檢測(cè)原理
:
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被
人水通道蛋白3(AQP-3)止抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入
人水通道蛋白3(AQP-3)
校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入另一株
HRP標(biāo)記的抗
人水通道蛋白3(AQP-3)
（酶標(biāo)抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體
-抗原-酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。加底物 A和 B，底物在 HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀
450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中
人水通道蛋白3(AQP-3)的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中
人ELISA試劑盒AQP-3的濃度。
所需器材和試劑
1、
酶標(biāo)儀
(波長(zhǎng) 450nm 濾光片)
2、37°C 恒溫箱(不推薦使用細(xì)胞用 CO2 培養(yǎng)箱)
3、
自動(dòng)洗板機(jī)或多道移液器
/5ml 滴管(手工洗板用)
4、
無菌的
EP 管及一次性吸頭
5、
精密的單道
(0.5-10μL, 5-50μL, 20-200μL, 200-1000μL)和多通道移液器(移液器使用前需校準(zhǔn))。
6、吸水紙及加樣槽
7、去離子水或蒸餾水
試劑盒組成：
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名稱
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48Ｔ
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96Ｔ
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抗體預(yù)包被酶標(biāo)板
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8×6
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8×12
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凍干標(biāo)準(zhǔn)品
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0.5 ng/支×2支
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0.5 ng/支×3支
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標(biāo)準(zhǔn)品
&標(biāo)本通用稀釋液
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12ml×1瓶
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20ml×1瓶
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濃縮生物素化抗體
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1支(規(guī)格見標(biāo)簽）
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1支(規(guī)格見標(biāo)簽）
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生物素化抗體稀釋液
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10ml×1瓶
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16ml×1瓶
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濃縮酶結(jié)合物
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1支(規(guī)格見標(biāo)簽）
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1支(規(guī)格見標(biāo)簽）
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酶結(jié)合物稀釋液
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10ml×1瓶
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16ml×1瓶
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濃縮洗滌液
20×
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25ml×1瓶
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50ml×1瓶
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顯色底物(TMB)
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6ml×1瓶
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12ml×1瓶
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反應(yīng)終止液具腐蝕性
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6ml×1瓶
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12ml×1瓶
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封板膠紙
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3張
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6張
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產(chǎn)品說明書
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1份
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1份
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標(biāo)本收集
:
1、收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2、
血漿抗凝劑推薦使用
EDTA 。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。
3、標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
4、
標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于
-20 ℃ , -70 ℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測(cè)。
5、
如果您的樣本中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，
做適當(dāng)倍數(shù)稀釋
(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。
儲(chǔ)存條件：
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未開封完整試劑盒
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4℃保存，請(qǐng)?jiān)诒Ｙ|(zhì)期內(nèi)使用
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已封完整試劑盒
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抗體包被板條
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未用完的板條放回帶拉鏈鋁箔袋，封好口
4℃條件下可儲(chǔ)存1個(gè)月左右
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標(biāo)準(zhǔn)品
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凍干粉
-20℃可儲(chǔ)存6 個(gè)月左右，
稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品使用后請(qǐng)丟棄
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濃縮生物素化抗體
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濃縮液
4℃可儲(chǔ)存1個(gè)月左右，
釋后即用即棄
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濃縮酶結(jié)合物(避光)
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標(biāo)準(zhǔn)品＆標(biāo)本通用稀釋液
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4℃條件下，可儲(chǔ)存1 個(gè)月左右
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生物素化抗體稀釋液
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酶結(jié)合物稀釋液
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顯色底物(避光)
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反應(yīng)終止液
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濃縮洗滌液
20×
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樣品采集及保存：
1、
血清全血樣本室溫放置
2小時(shí)或 2-8°C 過夜。1000×g 離心20分鐘，取上清。可立即檢測(cè)，或按一次使用量分裝凍存于-20°C 或-80°C。
2、
血漿抗凝劑推薦使用
EDTA-Na2/K2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C，1000×g 離心15分鐘，取上清。可立即檢測(cè)，或按一次使用量分裝凍存于-20°C
或-80°C。其他抗凝劑的使用及選擇請(qǐng)查看樣品制備指南。
3、組織樣本組織樣本一般制成組織勻漿，處理方法如下：
3.1、
將目標(biāo)組織置于冰上，用預(yù)冷的
PBS緩沖液(0.01M，pH=7.4)洗滌去除殘留的血液，稱重后備用。
3.2、
在冰上用裂解液研磨組織勻漿。加入裂解液的體積取決于組織的重量，一般情況每
1g 組織碎片使用9ml裂解液。另外建議在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如 1mM PMSF。
3.3、
可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理
(超聲破碎過程中，需冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2次)。
3.4、
將制備好的勻漿液于
5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測(cè)。或按一次使用量分裝凍存于-20°C 或-80°C。
3.5、
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，組織勻漿樣本可先測(cè)定總蛋白濃度
,以便于數(shù)據(jù)分析，推薦 BCA 法。一般調(diào)整總蛋白濃度至 1-3mg/ml 用于 ELISA 檢測(cè)。某些組織樣本，如肝臟，腎臟，胰腺因含有較高濃度的內(nèi)源性過氧物酶,
在樣品濃度較高的情況下會(huì)和顯色底物反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。可嘗試使用 1%H2O2 滅活 15min 再檢測(cè)。
注意：
裂解液常用
PBS 緩沖液，或使用中等強(qiáng)度 RIPA 裂解液。使用 時(shí)，PH 值需調(diào)整為PH7.3，避免使用含 NP-40，Triton X-100 和 DTT
的組分，會(huì)嚴(yán)重抑制試劑盒工作。推薦使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3，可自行配制或聯(lián)系我們購(gòu)買。
4、
細(xì)胞培養(yǎng)上清收集上清液，
2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。立即用于檢測(cè)，或按一次使用量分裝于-80°C 凍存?zhèn)溆谩?
5、細(xì)胞裂解液
5.1、
懸浮細(xì)胞的收集及裂解：
2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集細(xì)胞。再加入預(yù)冷的 PBS 輕輕混勻清洗，2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集細(xì)胞。加入 0.5-1ml
細(xì)胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(如 PMSF，工作濃度 1mmol/L)，置于冰上，裂解 30min-1h , 或者配合超聲波破碎。
5.2、
貼壁細(xì)胞的收集及裂解：吸走上清液，加入預(yù)冷的
PBS 洗三次。加入 0.5-1ml 細(xì)胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(如PMSF，工作濃度 1mmol/L)，用細(xì)胞刮輕輕刮下貼壁細(xì)胞。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，置于冰上，裂解
30min-1h，或者配合超聲波破碎。
5.3、
細(xì)胞裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管，使蛋白充分裂解
, 出現(xiàn)黏糊狀是 DNA，可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波 3-5mm 探頭，功率 150-300W, 冰上超聲處理樣品，工作 1-2 秒，停止 30 秒， 3~5 個(gè)循環(huán)。)
5.4、
裂解或超聲破碎完成，
2-8°C，10000rpm 離心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于檢測(cè)，或按一次使用量分裝于-80°C 凍存?zhèn)溆谩?/font>
注意：注意事項(xiàng)同組織樣本。
6、
其他生物樣本
2-8°C，1000×g 離心樣品 20 分鐘。收集上清液立即用于檢測(cè)，或按 一次使用量分裝于-80°C 凍存?zhèn)溆谩?/font>
操作步驟：
步驟
1：
向孔中加入
100ul 標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 90 分鐘。
洗板：
洗板
2 次。不浸泡。
步驟
2：
加入
100ul 生物素-抗體工作液，貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 60 分鐘。
洗板：
洗板
3 次。每次浸泡 1 分鐘。
步驟
3：
加入
100ul HRP-鏈霉親和素(SABC)工作液，貼上覆膜，37°C 靜置孵育 30 分鐘。
洗板：
洗板
5 次。每次浸泡 1 分鐘。
步驟
4：
添加
90ul TMB 顯色底物。貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 10-20 分鐘(請(qǐng)使用 TMB 顯色精準(zhǔn)控制方法)。
步驟
5：
添加
50ul 反應(yīng)終止液。立即在 450nm 處讀取 OD450 值并計(jì)算。
注意事項(xiàng)：
1、使用不同的試劑盒時(shí)，需先做好標(biāo)記，防止組分混用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
2、
試劑盒開啟后，酶標(biāo)板和標(biāo)準(zhǔn)品的保存條件請(qǐng)參考組件保存條件表格
(受潮后活性會(huì)下降)。如發(fā)生使用或保存不當(dāng)
導(dǎo)致組件缺損，可申請(qǐng)購(gòu)買配套組件
(如 E002 凍干標(biāo)準(zhǔn)品)。
3、請(qǐng)使用無菌一次性吸頭吸取試劑，使用后，須旋緊試劑瓶蓋，以防止微生物污染和蒸發(fā)。
4、手工洗板時(shí)，加洗液的吸頭或滴管，切勿接觸酶標(biāo)板孔。不充分的洗滌或污染容易造成假陽(yáng)性和高背景。
5、檢測(cè)過程中，請(qǐng)?zhí)崆皽?zhǔn)備好下一步實(shí)驗(yàn)所需試劑，洗板后及時(shí)將試劑加入板孔，防止板孔干燥，導(dǎo)致檢測(cè)失效。
6、在未經(jīng)確認(rèn)的情況下，請(qǐng)勿將其他批次試劑盒的試劑或其他來源的試劑用于本試劑盒。
7、請(qǐng)勿重復(fù)使用一次性吸頭，以免造成交叉污染。
8、加樣完成，貼覆膜以防孵育過程樣品的蒸發(fā)，在推薦溫度下完成孵育過程。
9、試驗(yàn)中請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服、戴口罩、手套等，做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品時(shí)，請(qǐng)按生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。
總結(jié)：感謝您選用本公司ELISA系列產(chǎn)品。本產(chǎn)品可檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、腦脊液、胸腔積液、組織勻漿液等多種類型樣本人ELISA試劑盒AQP-3濃度，具體適用樣本請(qǐng)咨詢本商鋪。
酶聯(lián)生物經(jīng)過不斷的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和改進(jìn)，積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，擁有專業(yè)的酶聯(lián)研發(fā)團(tuán)隊(duì)。利用專業(yè)的酶聯(lián)免疫技術(shù)自主研發(fā)的elisa試劑盒，能對(duì)血清及其它樣本定量檢測(cè)抗原，定性檢測(cè)特異性抗體。優(yōu)質(zhì)的試劑，先進(jìn)的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA檢測(cè)的方便性、穩(wěn)定性、重復(fù)性和可靠性方面都具有很大的優(yōu)勢(shì)。
ELISA檢測(cè)技術(shù)服務(wù)內(nèi)容：
1、雙抗體夾心法檢測(cè)抗原 2、間接法檢測(cè)抗體 3、為客戶提供各種ELISA技術(shù)進(jìn)行樣本檢測(cè)。
以上代測(cè)費(fèi)，凡購(gòu)買本公司試劑盒，我們免費(fèi)代測(cè)！
凡購(gòu)買本公司目錄任何一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，您只需將需要檢測(cè)的動(dòng)物（Human, Rat, Mouse, Rabbit, Monkey,
Pig……）種類和檢測(cè)指標(biāo)（白介素類、激素類）及標(biāo)本數(shù)量（48T/96T）通知公司業(yè)務(wù)員即可。在接到客戶標(biāo)本當(dāng)日起，現(xiàn)貨產(chǎn)品一周內(nèi)將檢測(cè)報(bào)告交到客戶手中！
歡迎各科研單位在各種項(xiàng)目上與我們公司開展不同層次的密切合作，以雙贏求發(fā)展，共同進(jìn)步，為中國(guó)檢測(cè)事業(yè)的發(fā)展積累經(jīng)驗(yàn)。
二、樣本要求
在收集標(biāo)本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。我們提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測(cè)，對(duì)收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本，及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本，請(qǐng)?jiān)炷Ｈ〔暮螅瑢?biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。代測(cè)放免標(biāo)本的客戶取材前須向我司銷售人員索要說明書，具體操作注意事項(xiàng)請(qǐng)與我司技術(shù)人員溝通。
液體類標(biāo)本：標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。
血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
血漿：應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10%（v/v）抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1%heparin
或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
尿液、胸腹水、腦脊液：用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.0-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，緩沖液中可加入1μg/L蛋白酶抑制劑或50U/ml的Aprotinin（抑肽酶）。用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清置于-20度或-70度保存，如有必要，可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
三、寄標(biāo)本時(shí)需注明以下情況：
1、標(biāo)本編號(hào)；2、所測(cè)項(xiàng)目；3、是否做復(fù)孔；3、聯(lián)系方式；4、實(shí)驗(yàn)后標(biāo)本是否寄回。
客戶須知：
客戶應(yīng)對(duì)所提供的材料及信息負(fù)責(zé)，如因客戶提供的材料及信息不準(zhǔn)確而引起的實(shí)驗(yàn)延誤或經(jīng)濟(jì)損失由客戶承擔(dān)。
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